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| Plate-forme Transcriptome | |
| . | Concept des puces à ADN |
| . | Plate-forme transcriptome du Service de génomique fonctionnelle |
| . | Accès à la plate-forme |
| Le concept des puces à ADN |
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La technologie des puces à ADN ou bio-puces, connaît à l'heure actuelle un essor exceptionnel et suscite un formidable intérêt dans la communauté scientifique. Grâce à cette méthodologie, la mesure simultanée du niveau d'expression de plusieurs milliers de gènes voire d'un génome entier dans des dizaines de conditions différentes, physiologiques ou pathologiques, est aujourd'hui techniquement possible. Son utilité est scientifiquement incontestable car la connaissance du niveau d'expression dun gène dans ces différentes situations constitue une avancée vers sa fonction, mais également vers le criblage de nouvelles molécules et l'identification de nouveaux médicaments et de nouveaux outils de diagnostic.
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Les puces à ADN consistent en un support solide (petite lame de verre comme celles utilisées en microscopie traditionnelle ou membrane de nylon) sur lequel des milliers de fragment d'ADN sont déposés de façon géométrique à l'aide d'une micropipette robotisée. Grâce à cette technique, chacun des fragments d'ADN est représenté par un point sur le support (ou puce). Ils servent de sondes pour fixer de façon très spécifique les fragments de gènes complémentaires (cibles), présents dans les échantillons biologiques à tester : leur mise en contact permet de reconstituer la double hélice d'ADN. Ce phénomène (hybridation) peut être mis en évidence par des techniques optiques sous éclairage fluorescent ou par détection de radioactivité ; un système de « marquage » de l'échantillon au moyen de traceurs fluorescents ou radioactifs ayant été réalisé préalablement. La quantification des signaux obtenus et l'identification des fragments de gènes reconnus sont ensuite rendues possibles au moyen d'un système d'acquisition d'image puis d'analyse des données faisant appel à des logiciels informatiques spécialement conçus à cet effet. Les résultats obtenus sont ensuite validés sur le plan statistique et interprétés dans un contexte biologique. Schéma général du concept d'une puce à ADN
Le potentiel de cette méthodologie est énorme, mais la masse de résultats qui résulte de ces expériences est considérable et leur exploitation par le biais de programmes informatiques n'en est encore qu'à ses débuts. De nombreux développements sont encore à faire au niveau des logiciels d'analyse et de représentation afin d'interpréter ces données sur le plan biologique. Le terme « puces à ADN » est un terme générique. Il existe actuellement 2 procédés majeurs de fabrications de puces à ADN ce qui permet de distinguer différents types de puces :
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Les macroarrays ou filtres à haute densité : Les dépôts (sondes) sont des clones d'ADNc ou des produits de PCR fixés à haute densité sur une membrane de nylon (8 x 12 cm). Le marquage est le plus souvent radioactif et le criblage est réalisé en excès de cible, on obtient ainsi une mesure de l'abondance relative de chacun des ARNm présent dans l'échantillon de départ. On parle de macroarrays jusqu'à une densité d'environ 25 fragments ADN déposé par cm2. Filtres à haute densité au macroarrays
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Ils permettent la miniaturisation des dépôts d'ADN, ce qui permet de fixer plusieurs milliers de sondes sur des surfaces égales ou inférieures à celle d'une lame de microscope standard. Elles sont déposées à une densité de 1 000 sondes/cm2 par un robot sur des lames de verre au préalablement traitées chimiquement, soit jusqu'à 12 000 sondes/lame. Les sondes sont généralement des ADN double brin de longueur de 200 à 2000 bp amplifiés par la technique de PCR mais récemment, des oligonucléotides longs (50-70 mers) ont également été greffés sur la puce après leur synthèse. Les cibles utilisées sont réalisées par transcription inverse, à partir d'ARN total ou messager utilisant 2 fluorochromes différents (Cy3 et Cy5) ce qui permet d'hybrider simultanément 2 cibles sur une même sonde. Les signaux d'hybridation sont analysés grâce à un lecteur capable de discriminer les 2 fluorochromes et de générer deux images dont le niveau de gris représente l'intensité de la fluorescence lue. Si on remplace les niveaux de gris par des niveaux de couleur verte pour la première image et rouge pour la seconde, on obtient en les superposant une image en fausses couleurs composée de spots allant du vert au rouge en passant par le jaune. Un excès du gène X dans l'échantillon marqué en rouge donnera un signal rouge ; un excès du gène Y dans l'échantillon en vert donnera un signal vert ; une expression équivalente du gène Z dans les deux échantillons donnera un signal jaune. On calcule ensuite le ratio des intensités de fluorescence rouge/fluorescence verte pour chacun des spots ce qui permet de rechercher une expression différentielle des gènes dans les 2 échantillons biologiques étudiés. Généralement, on fixe la limite d'un ratio supérieur à 2 ou inférieur à 0,5 pour considérer qu'un gène est sur- ou sous- exprimé dans une des cibles par rapport à l'autre. On peut ensuite essayer de regrouper des gènes ayant le même profil d'expression sur plusieurs expériences ayant un rapport biologique. Principe d'une hybridation sur microarrays
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Elles dérivent à l'origine d'un projet de séquençage par hybridation. Les puces les plus couramment utilisées sont les puces de la société Affymetrix. Dans ce cas, les sondes sont des oligonucléotides synthétisés in situ par une technique de photolithographie. On peut synthétiser jusqu'à 300 000 oligonucléotides représentant 30 000 gènes sur une puce d'une surface d'environ 1 cm2. On hybride une seule sonde par puce et l'intensité de fluorescence mesurée par un scanner permet une mesure de l'abondance relative de chacun des ARNm présent dans l'échantillon biologique étudié. Puces à oligonucléotides (Affymetrix)
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