Plate-forme transcriptome du Service de génomique fonctionnelle

• les équipements
• les ressources
• l'équipe
• la méthodologie
• les protocoles
• le bilan de l'activité du SGF en 2002

La plate-forme transcriptome du SGF est une plate-forme de type « microrarrays »

« Exemple d'une image d'hybridation obtenue au SGF sur microarrays »

Hybridation de l'ensemble des séquences codantes (ORF) de la levure Saccharomyces cerevisiae

Les équipements :

• 2 robots spotteurs :
  • Microgrid II de Biorobotics avec des aiguilles pleines.
• 1 robot manipulateur de liquides CyberlabC250 (Gilson)
• 3 scanners
  • 1 lecteur 4000b Axon
  • 1 lecteur Agilent
  • 1 lecteur ScanArray5000 de Packard
• 1 BioAnalyser Agilent
• 1 appareil de RT-PCR quantitative ABI Prism (Perkin Elmer)
• 2 serveurs Sun Microsystem 450
• Plusieurs logiciels d'analyse d'images (Genepix Pro 4.0 ; Genespring 6.0)
• Un trieur de cellules de type Mo Flo (Cytomation)

Les ressources

Le SGF produit aujourd'hui des puces, homme, souris, levure.

La puce Homme :

• Une lame pangénomique développée sous l'égide du Réseau national Genopole (RNG) contenant 26 400 oligonucléotides (50 - 70 mers)

La puce Souris :

• 15 000 clones d'ADNc provenant de Research Genetics
• Une lame pangénomique développée sous l'égide du Réseau national Genopole (RNG) contenant 26 400 oligonucléotides (50 - 70 mers)
• 15 000 clones d'ADNc fournis par le National Institute of Aging (NIA), correspondant à 11 000 gènes.

Les puces Levure :

• 6 316 gènes de levure (l'ensemble des ORF)

Télécharger la liste des gènes murins (RDNA, NIA). Documents au format PDF (843 Ko).

La liste des oligonucléotides est accessible sur le site MEDIANTE : http://medcal.impc.cnrs.fr/mediante/index.htm

Les puces Levure et Arabidopsis sont destinées aux équipes CEA.

L'équipe

Xavier Gidrol, chercheur INRA, chef du Service de Genomique Fonctionnelle

Franck Amiot, ingénieur CEA, responsable de la production

Amélie Robert et Peggy Maltère, techniciennes CEA en production.

Vincent Frouin, Olivier Alibert, Cyrille Petat, bioinformaticiens, CEA.

La méthodologie

La fabrication des puces

Aujourd'hui nous fabriquons des puces sur lames de verre sur lesquelles sont déposés des produits de PCR ou des oligonucléotides.

• La génération des sondes par PCR est effectuée soit avec des amorces localisées dans le vecteur, soit avec des amorces spécifiques localisées dans les exons ;
• Le dépôt des sondes est effectué avec le robot Microgrid II BioRobotics sur lames de verre Amino Silane (CMT GAPS II, Corning) ;
• Une démarche qualité a été mise en place au sein de la plate-forme. Nous suivons les bonnes pratiques de laboratoire avec une liste de procédures standards référencées et répertoriées. Quatre tests de qualité, pratiqués selon des procédures standards, sont réalisés sur chaque lame tout au long de la chaîne de production. Nous sommes encore en train d'optimiser l'assurance qualité, notamment au niveau de la définition des seuils de rejet. Les contrôles-qualité des puces comprennent :

  1. avant spotting, un contrôle qualitatif sur gel (voir le schéma: « Contrôle qualité des produits PCR » - au format PDF) ;

  2. avant spotting, un contrôle quantitatif sur plaques (dosage en picogreen) ;

  3. après spotting une visualisation des spots en Sybergreen ;

  4. après spotting, une hybridation avec des ARNs (Human Universal RNA, Stratagene) sur 4 à 5% du lot produit.

Les protocoles expérimentaux

Préparation des ARNs (Téléchargez le protocole de préparation des ARNs en bas de page).

Marquage des cibles

Le marquage des cibles consiste en l'incorporation de nucléotides portant soit le fluorochrome Cyanine 3 (cy3) soit la Cyanine 5 (cy5). Les cibles marquées sont ensuite mélangées et hybridées sur la même puce, ce qui permet une comparaison immédiate des 2 populations d'acides nucléiques.

Nous utilisons 2 types de marquage des cibles en fluorescence :
La réaction d'incorporation peut être directe, il s'agit alors d'une synthèse d'ADNc marqués par transcription reverse. Ce type de marquage est simple. (téléchargez le « protocole de marquage direct » en bas de page)

Dans la méthode de marquage indirect, le marquage se fait en 2 temps. D'abord synthèse de l'ADNc avec incorporation de nucléotides portant un groupement amino-allyl. Ensuite, fixation sur les groupements allyl, de groupements ester liés au fluorochrome (téléchargez le protocole de marquage indirect en bas de page).

Hybridation et lavages (téléchargez le document en bas de page).

Le traitement des données

L'analyse des signaux d'hybridation comprend les étapes suivantes :

- Localisation des spots et positionnement d'une grille
- Segmentation du signal, quantification de l'intensité de fluorescence et calcul du bruit de fond
- Application d'un facteur de correction pour éviter les différences d'intensité entre les 2 fluorochromes
- Application d'un facteur de normalisation
- Calcul des ratios entre les intensités des 2 fluorochromes et recherche des facteurs de modulation d'expression entre les 2 échantillons étudiés

L'équipe bioinformatique du SGF a développé des logiciels de gestion de ressources, d'analyse d'images et d'analyse de données. Nous disposons ainsi de deux chaînes d'analyse parallèle, la première développée au laboratoire et la seconde à partir des logiciels commerciaux Genepix et GeneSpring.
Cette équipe implémente également une base de données de profils d'expression.

Les protocoles

Document	Format	Taille
- Protocole de marquage direct		9 Ko
- Protocole d'hybridation et lavages		19 Ko
- Protocole de préparation des ARNs		5 Ko
- Réactifs de marquage indirect		8 Ko
- Réactifs de marquage direct		13 Ko
- Protocole de marquage indirect		19 Ko

Publications

Global proteomic adaptation for optimal sulfur economy in Saccharomyces cerevisiae. M Fauchon, G Lagniel, JC Aude, L Lombardia, P Soularue, C Petat, G Marguerie, M Werner et J Labarre. Molecular Cell,2002, 9, 713-723.

Les puces à ADN. P Soularue et X Gidrol. Techniques de l’ingénieur . Sous presse.

Gene and protein expression analysis of human keratinocytes during differentiation. Lemaître G, Lamartine J, Pitaval A, Garin, Sivan V, Tricaud Y, Gidrol X, Martin M and Waksman G. Soumis pour publication. Soumis à Exp. dermatol.

J Lamartine, N Franco, P le Minter, P Soularue, O Alibert, JJ Leplat, X Gidrol, G Waksman, M Martin. Gene expression profiling of human keratinocytes exposed to gamma rays reveals global reprogramming and immediate burst of energy. Soumis à Physiological Genomics

Benchaouir R, Israeli D, Decraene C, , Rameau P, Ziaei S, Piétu G, Danos O, Garcia L. Evidence for a resident subset of cells with SP phenotype in the C2C12 myogenic line : a tool to explore muscle stem cell biology. Soumis à FASEB J.

Bilan de l'activité du SGF en 2002

Le SGF a produit 2557 puces en 2001. En 2002, 3 900 puces ont été produites dont. les utilisateurs se répartissent de la façon suivante :

- 34% des puces ont été utilisées en interne au SGF
- 41% ont été fournies à d'autres laboratoires du CEA
- 25% des puces produites ont été fournies à l'extérieur, pour alimenter nos contrats (européens ou nationaux) et les équipes académiques demandeuses.

Notre capacité de production actuelle est de 10 000 puces par an.

Pour en savoir plus sur la plate-forme transcriptome nationale :

- Site national de la plate-forme transcriptome
- Site web du réseau national des génopoles : plate-forme Transcriptome